第十二章 RNA的生物合成

一、RNA轉錄合成的特點：

在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶的遺傳信息傳遞給RNA的過程稱為轉錄。經轉錄生成的RNA有多種，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。

1.轉錄的不對稱性：指以雙鏈DNA中的一條鏈作為模板進行轉錄，從而將遺傳信息由DNA傳遞給RNA。對于不同的基因來說，其轉錄信息可以存在于兩條不同的DNA鏈上。能夠轉錄RNA的那條DNA鏈稱為有意義鏈(模板鏈)，而與之互補的另一條DNA鏈稱為反意義鏈(編碼鏈)。

2.轉錄的連續(xù)性：RNA轉錄合成時，在RNA聚合酶的催化下，連續(xù)合成一段RNA鏈，各條RNA鏈之間無需再進行連接。

3.轉錄的單向性：RNA轉錄合成時，只能向一個方向進行聚合，RNA鏈的合成方向為5’→3’。

4.有特定的起始和終止位點：RNA轉錄合成時，只能以DNA分子中的某一段作為模板，故存在特定的起始位點和特定的終止位點。

二、RNA轉錄合成的條件：

1.底物：四種核糖核苷酸，即ATP，GTP，CTP，UTP。

2.模板：以一段單鏈DNA作為模板。

3.RNA聚合酶(DDRP)： RNA聚合酶在單鏈DNA模板以及四種核糖核苷酸存在的條件下，不需要引物，即可從5’→3’聚合RNA。

原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個亞基構成，即α2ββ’σ。σ亞基與轉錄起始點的識別有關，而在轉錄合成開始后被釋放，余下的部分(α2ββ’)被稱為核心酶，與RNA鏈的聚合有關。

真核生物中的RNA聚合酶分為三種：RNA polⅠ存在于核仁，對α-鵝膏蕈堿不敏感，用于合成rRNA前體;RNA polⅡ存在于核基質，對α-鵝膏蕈堿極敏感，用于合成HnRNA;RNA polⅢ存在于核基質，對α-鵝膏蕈堿敏感，用于合成tRNA前體、snRNA及5S rRNA。

4.終止因子ρ蛋白：這是一種六聚體的蛋白質，能識別終止信號，并能與RNA緊密結合，導致RNA的釋放。

5.激活因子：降解產物基因激活蛋白(CAP)，又稱為cAMP受體蛋白(CRP)，是一種二聚體蛋白質。該蛋白與cAMP結合后，刺激RNA聚合酶與起始部位結合，從而起始轉錄過程。

三、RNA轉錄合成的基本過程：

1.識別：RNA聚合酶中的σ因子識別轉錄起始點，并促使核心酶結合形成全酶復合物。

位于基因上游，與RNA聚合酶識別、結合并起始轉錄有關的一些DNA順序稱為啟動子。在原核生物中的啟動子通常長約60bp，存在兩段帶共性的順序，即5’-TTGACA-3’和5’-TATAATG-3’，其中富含TA的順序被稱為Pribnow盒。真核生物的啟動子中也存在一段富含TA的順序，被稱為Hogness盒或TATA盒。

2.起始：RNA聚合酶全酶促使局部雙鏈解開，并催化ATP或GTP與另外一個三磷酸核苷聚合，形成第一個3’,5’-磷酸二酯鍵。

3.延長：σ因子從全酶上脫離，余下的核心酶繼續(xù)沿DNA鏈移動，按照堿基互補原則，不斷聚合RNA。

4.終止：RNA轉錄合成的終止機制有兩種。

⑴自動終止：模板DNA鏈在接近轉錄終止點處存在相連的富含GC和AT的區(qū)域，使RNA轉錄產物形成寡聚U及發(fā)夾形的二級結構，引起RNA聚合酶變構及移動停止，導致RNA轉錄的終止。

⑵依賴輔助因子的終止：由終止因子(ρ蛋白)識別特異的終止信號，并促使RNA的釋放。

四、真核生物RNA轉錄后的加工修飾：

1.mRNA的轉錄后加工：

⑴加帽：即在mRNA的5’-端加上m7GTP的結構。此過程發(fā)生在細胞核內，即對HnRNA進行加帽。加工過程首先是在磷酸酶的作用下，將5’-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結構，再對G進行甲基化。

⑵加尾：這一過程也是細胞核內完成，首先由核酸外切酶切去3’-端一些過剩的核苷酸，然后再加入polyA。

⑶剪接：真核生物中的結構基因基本上都是斷裂基因。結構基因中能夠指導多肽鏈合成的編碼順序被稱為外顯子，而不能指導多肽鏈合成的非編碼順序就被稱為內含子。真核生物HnRNA的剪接一般需snRNA參與構成的核蛋白體參加，通過形成套索狀結構而將內含子切除掉。

⑷內部甲基化：由甲基化酶催化，對某些堿基進行甲基化處理。

2.tRNA的轉錄后加工：

主要加工方式是切斷和堿基修飾。

3.rRNA的轉錄后加工：

主要加工方式是切斷。

十三章、蛋白質生物合成

生物體內的各種蛋白質都是生物體利用約20種氨基酸為原料自行合成的。蛋白質的生物合成過程，就是將DNA傳遞給mRNA的遺傳信息，再具體的解譯為蛋白質中氨基酸排列順序的過程，這一過程被稱為翻譯(translation)。參與蛋白質生物合成的各種因素構成了蛋白質合成體系，該體系包括：

1.mRNA：作為指導蛋白質生物合成的模板。

mRNA中每三個相鄰的核苷酸組成三聯體，代表一個氨基酸的信息，此三聯體就稱為密碼。共有64種不同的密碼。遺傳密碼具有以下特點：① 連續(xù)性;② 簡并性;③ 通用性;④ 方向性;⑤ 擺動性;⑥ 起始密碼：AUG;終止密碼：UAA、UAG、UGA。

2.tRNA：在氨基酸t(yī)RNA合成酶催化下，特定的tRNA可與相應的氨基酸結合，生成氨基酰tRNA，從而攜帶氨基酸參與蛋白質的生物合成。

tRNA反密碼環(huán)中部的三個核苷酸構成三聯體，可以識別mRNA上相應的密碼，此三聯體就稱為反密碼。 反密碼對密碼的識別，通常也是根據堿基互補原則，即A—U，G—C配對。但反密碼的第一個核苷酸與第三核苷酸之間的配對，并不嚴格遵循堿基互補原則，這種配對稱為不穩(wěn)定配對。

能夠識別mRNA中5′端起動密碼AUG的tRNA稱為起動tRNA。在原核生物中，起動tRNA是tRNAfmet;而在真核生物中，起動tRNA是tRNAmet。

3.rRNA和核蛋白體：原核生物中的核蛋白體大小為70S，可分為30S小亞基和50S大亞基。真核生物中的核蛋白體大小為80S，也分為40S小亞基和60S大亞基。核蛋白體的大、小亞基分別有不同的功能：

⑴小亞基：可與mRNA、GTP和起動tRNA結合。

⑵大亞基：①具有兩個不同的tRNA結合點。A位—— 受位或氨?；唬膳c新進入的氨基酰tRNA結合;P位——給位或肽?；?，可與延伸中的肽酰基tRNA結合。②具有轉肽酶活性。

在蛋白質生物合成過程中，常常由若干核蛋白體結合在同一mRNA分子上，同時進行翻譯。由若干核蛋白體結合在一條mRNA上同時進行多肽鏈的翻譯所形成的念球狀結構稱為多核蛋白體。

4.起動因子(IF)：這是一些與多肽鏈合成起動有關的蛋白因子。原核生物中存在3種起動因子，分別稱為IF1-3。在真核生物中存在9種起動因子(eIF)。其作用主要是促進核蛋白體小亞基與起動tRNA及模板mRNA結合。

5.延長因子(EF)：原核生物中存在3種延長因子(EFTU，EFTS，EFG)，真核生物中存在2種(EF1，EF2)。其作用主要促使氨基酰tRNA進入核蛋白的受體，并可促進移位過程。

6.釋放因子(RF)：原核生物中有4種，在真核生物中只有1種。其主要作用是識別終止密碼，協(xié)助多肽鏈的釋放。

7.氨基酰tRNA合成酶：該酶存在于胞液中，與特異氨基酸的活化以及氨基酰tRNA的合成有關。每種氨基酰tRNA合成酶對相應氨基酸以及攜帶氨基酸的數種tRNA具有高度特異性。

二、蛋白質生物合成過程：

1.氨基酸的活化與搬運：氨基酸的活化以及活化氨基酸與tRNA的結合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。反應完成后，特異的tRNA3’端CCA上的2’或3’位自由羥基與相應的活化氨基酸以酯鍵相連接，形成氨基酰tRNA。

2.活化氨基酸的縮合——核蛋白體循環(huán)：活化氨基酸在核蛋白體上反復翻譯mRNA上的密碼并縮合生成多肽鏈的循環(huán)反應過程，稱為核蛋白體循環(huán)。核蛋白體循環(huán)過程可分為三個階段：

⑴起動階段：①30S起動復合物的形成。在IF促進下，30S小亞基與mRNA的起動部位，起動tRNA(tRNAfmet)，和GTP結合，形成復合體。②70S起動前復合體的形成。IF3從30S起動復合體上脫落，50S大亞基與復合體結合，形成70S起動前復合體。③70S起動復合體的形成。GTP被水解，IF1和IF2從復合物上脫落。

⑵肽鏈延長階段：①進位：與mRNA下一個密碼相對應的氨基酰tRNA進入核蛋白體的受位。此步驟需GTP，Mg2+，和EF參與。②成肽：在轉肽酶的催化下，將給位上的tRNA所攜帶的甲酰蛋氨酰基或肽?；D移到受位上的氨基酰tRNA上，與其α-氨基縮合形成肽鍵。給位上已失去蛋氨?；螂孽；膖RNA從核蛋白上脫落。③移位：核蛋白體向mRNA的3’- 端滑動相當于一個密碼的距離，同時使肽酰基tRNA從受體移到給位。此步驟需EF(EFG)、GTP和Mg2+參與。 此時，核蛋白體的受位留空，與下一個密碼相對應的氨基酰tRNA即可再進入，重復以上循環(huán)過程，使多肽鏈不斷延長。

⑶肽鏈終止階段：核蛋白體沿mRNA鏈滑動，不斷使多肽鏈延長，直到終止信號進入受位。①識別：RF識別終止密碼，進入核蛋白體的受位。②水解：RF使轉肽酶變?yōu)樗饷福嚯逆溑ctRNA之間的酯鍵被水解，多肽鏈釋放。③解離：通過水解GTP，使核蛋白體與mRNA分離，tRNA、RF脫落，核蛋白體解離為大、小亞基。

三、多肽鏈合成后的加工修飾：

1.一級結構的加工修飾：

⑴N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽鏈合成的起始氨基酸，必須在多肽鏈折迭成一定的空間結構之前被切除。其過程是：① 去甲?；?② 去蛋氨?；?。

⑵氨基酸的修飾：由專一性的酶催化進行修飾，包括糖基化、羥基化、磷酸化、甲?；?。

⑶二硫鍵的形成：由專一性的氧化酶催化，將-SH氧化為-S-S-。

⑷肽段的切除：由專一性的蛋白酶催化，將部分肽段切除。

2.高級結構的形成：

⑴構象的形成：在分子內伴侶、輔助酶及分子伴侶的協(xié)助下，形成特定的空間構象。

⑵亞基的聚合。

⑶輔基的連接。

3.靶向輸送：蛋白質合成后，定向地被輸送到其執(zhí)行功能的場所稱為靶向輸送。大多數情況下，被輸送的蛋白質分子需穿過膜性結構，才能到達特定的地點。因此，在這些蛋白質分子的氨基端，一般都帶有一段疏水的肽段，稱為信號肽。分泌型蛋白質的定向輸送，就是靠信號肽與胞漿中的信號肽識別粒子(SRP)識別并特異結合，然后再通過SRP與膜上的對接蛋白(DP)識別并結合后，將所攜帶的蛋白質送出細胞。

第十四章 基因表達調控

一、基因表達調控基本概念與原理：

1.基因表達的概念：基因表達(gene expression)就是指在一定調節(jié)因素的作用下，DNA分子上特定的基因被激活并轉錄生成特定的RNA，或由此引起特異性蛋白質合成的過程。

2.基因表達的時間性及空間性：

⑴時間特異性：基因表達的時間特異性(temporal specificity)是指特定基因的表達嚴格按照特定的時間順序發(fā)生，以適應細胞或個體特定分化、發(fā)育階段的需要。故又稱為階段特異性。

⑵空間特異性：基因表達的空間特異性(spatial specificity)是指多細胞生物個體在某一特定生長發(fā)育階段，同一基因的表達在不同的細胞或組織器官不同，從而導致特異性的蛋白質分布于不同的細胞或組織器官。故又稱為細胞特異性或組織特異性。

3.基因表達的方式：

⑴組成性表達：組成性基因表達(constitutive gene expression)是指在個體發(fā)育的任一階段都能在大多數細胞中持續(xù)進行的基因表達。其基因表達產物通常是對生命過程必需的或必不可少的，且較少受環(huán)境因素的影響。這類基因通常被稱為管家基因(housekeeping gene)。

⑵誘導和阻遏表達：誘導表達(induction)是指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被激活，從而使基因的表達產物增加。這類基因稱為可誘導基因。阻遏表達(repression)是指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被抑制，從而使基因的表達產物減少。這類基因稱為可阻遏基因。

4.基因表達的生物學意義：①適應環(huán)境、維持生長和增殖。②維持個體發(fā)育與分化。

5.基因表達調控的基本原理：

⑴基因表達的多級調控：基因表達調控可見于從基因激活到蛋白質生物合成的各個階段，因此基因表達的調控可分為轉錄水平(基因激活及轉錄起始)，轉錄后水平(加工及轉運)，翻譯水平及翻譯后水平，但以轉錄水平的基因表達調控最重要。

⑵基因轉錄激活調節(jié)基本要素：①順式作用元件：順式作用元件(cis-acting element)又稱分子內作用元件，指存在于DNA分子上的一些與基因轉錄調控有關的特殊順序。②反式作用因子：反式作用因子(trans-acting factor)又稱為分子間作用因子，指一些與基因表達調控有關的蛋白質因子。反式作用因子與順式作用元件之間的共同作用，才能夠達到對特定基因進行調控的目的。③順式作用元件與反式作用因子之間的相互作用：大多數調節(jié)蛋白在與DNA結合之前，需先通過蛋白質-蛋白質相互作用，形成二聚體或多聚體，然后再通過識別特定的順式作用元件，而與DNA分子結合。這種結合通常是非共價鍵結合。

二、操縱子的結構與功能：

在原核生物中，若干結構基因可串聯在一起，其表達受到同一調控系統(tǒng)的調控，這種基因的組織形式稱為操縱子。典型的操縱子可分為控制區(qū)和信息區(qū)兩部分。信息區(qū)由一個或數個結構基因串聯在一起組成;控制區(qū)通常由調節(jié)基因(阻抑蛋白編碼基因)、啟動基因(CRP和RNA聚合酶結合區(qū))和操縱基因(阻抑蛋白結合位點)構成。

1.原核生物乳糖操縱子：

原核生物乳糖操縱子(Lac operon)的控制區(qū)包括調節(jié)基因，啟動基因(其CRP結合位點位于RNA聚合酶結合位點上游)和操縱基因;其信息區(qū)由β-半乳糖苷酶基因(lacZ)，通透酶基因(lacY)和乙?；富?lacA)串聯在一起構成。當培養(yǎng)基中乳糖濃度升高而葡萄糖濃度降低時，乳糖作為誘導劑與阻抑蛋白結合，促使阻抑蛋白與操縱基因分離;另一方面，細胞中cAMP濃度升高，cAMP與CRP結合并使之激活，CRP與啟動基因結合并促使RNA聚合酶與啟動基因結合，基因轉錄激活。

2.原核生物色氨酸操縱子：

色氨酸操縱子(trp operon)屬于阻遏型操縱子，主要調控一系列用于色氨酸合成代謝的酶蛋白的轉錄合成。色氨酸操縱子通常處于開放狀態(tài)，其輔阻遏蛋白不能與操縱基因結合而阻遏轉錄。而當色氨酸合成過多時，色氨酸作為輔阻遏物與輔阻遏蛋白結合而形成阻遏蛋白，后者與操縱基因結合而使基因轉錄關閉。色氨酸操縱子的調控還涉及轉錄衰減(attenuation)機制。即在色氨酸操縱子第一個結構基因與啟動基因之間存在有一衰減區(qū)域，當細胞內色氨酸酸濃度很高時，通過與轉錄相偶聯的翻譯過程，形成一個衰減子結構，使RNA聚合酶從DNA上脫落，導致轉錄終止。

3.原核生物轉錄的整體調控模式：

由成群的操縱子組成的基因轉錄調控網絡稱為調節(jié)子。通過組成調節(jié)子調控網絡，對若干操縱子及若干蛋白質的合成進行協(xié)同調控，從而達到整體調控的目的。典型的整體調控模式是SOS反應，這是由一組與DNA損傷修復有關的酶和蛋白質基因組成。在正常情況下，這些基因均被LexA阻遏蛋白封閉。當有紫外線照射時，細菌體內的RecA蛋白水解酶被激活，催化LexA阻遏蛋白裂解失活，從而導致與DNA損傷修復有關的基因表達。

三、真核基因組結構特點：

1.轉錄產物為單順反子：真核基因的轉錄產物一般是單順反子(mono-cistron)，即一個編碼基因轉錄生成一個mRNA分子，并指導翻譯一條多肽鏈。

2.大量重復序列：真核基因組中含大量的重復序列，這些重復序列大部分是沒有特定生物學功能的DNA片段，可占整個基因組DNA的90%。根據重復頻率可將其分為高度重復序列、中度重復序列和單拷貝序列。

3.斷裂基因：真核生物中的基因具有不連續(xù)性，即一個基因的編碼序列往往被一些非編碼序列分隔開?；蛑心軌蜣D錄并進一步編碼多肽鏈合成的部分稱為外顯子(exon)，而在轉錄后會被剪除的部分則稱為內含子(intron)。

三、真核基因表達調控的特點：

1.RNA聚合酶活性受轉錄因子調控：真核生物中存在RNA polⅠ、Ⅱ、Ⅲ三種不同的RNA聚合酶，分別負責轉錄不同的RNA。這些RNA聚合酶與相應的轉錄因子形成復合體，從而激活或抑制該酶的催化活性。

2.染色質結構改變參與基因表達的調控：真核生物DNA與組蛋白結合并形成核小體的結構，再進一步形成染色質。當真核基因被激活時，染色質的結構也隨之發(fā)生改變。主要的改變有：

⑴單鏈DNA形成：基因被激活后，雙鏈DNA解開成單鏈以利于轉錄，從而形成一些對DNAaseⅠ的超敏位點。

⑵DNA拓樸結構改變：天然雙鏈DNA均以負性超螺旋構象存在，當基因激活后，則轉錄區(qū)前方的DNA拓樸結構變?yōu)檎猿菪Ｕ猿菪勺璧K核小體形成，并促進組蛋白解聚。

⑶核小體不穩(wěn)定性增加：由于組蛋白修飾狀態(tài)改變，巰基暴露等原因而引起核小體結構改變。

4.正性調節(jié)占主導：真核基因一般都處于阻遏狀態(tài)，RNA聚合酶對啟動子的親和力很低。通過利用各種轉錄因子正性激活RNA聚合酶是真核基因調控的主要機制。

5.轉錄和翻譯過程分別進行：轉錄與翻譯過程分別存在于不同的亞細胞部位，可分別進行調控。

6.轉錄后加工修飾過程復雜：特別是mRNA，轉錄后僅形成其初級轉錄產物——HnRNA，然后再經剪接、加帽、加尾等加工修飾，才能轉變?yōu)槌墒斓膍RNA。

四、真核基因轉錄調控元件及激活機制：

1.順式作用元件(分子內作用元件)：

⑴啟動子：存在于結構基因上游，與基因轉錄啟動有關的一段特殊DNA順序稱為啟動子。與原核生物類似，也含有一段富含TATA的順序，稱為TATA盒。除此之外，還可見CAAT盒和GC盒。

⑵增強子：位于結構基因附近，能夠增強該基因轉錄活性的一段DNA順序稱為增強子。增強子的特點是：①在轉錄起始點5’或3’側均能起作用;②相對于啟動子的任一指向均能起作用;③發(fā)揮作用與受控基因的遠近距離相對無關;④對異源性啟動子也能發(fā)揮作用;⑤通常具有一些短的重復順序。

⑶沉默子：能夠對基因轉錄起阻遏作用的DNA片段，屬于負性調控元件。

2.反式作用因子(分子間作用因子)：真核生物反式作用因子通常屬于轉錄因子(transcription factor，TF)。

(1)轉錄因子的種類：①非特異性轉錄因子(基本轉錄因子)：非選擇性調控基因轉錄表達的蛋白質因子稱為非特異性轉錄因子。真核生物中存在的三種RNA聚合酶分別有相應的轉錄因子，即TFⅠ，TFⅡ，TFⅢ。其中，TFⅡ一共有六種亞類。TFⅡD是唯一能識別啟動子TATA盒并與之結合的轉錄因子，而TFⅡB則可促進聚合酶Ⅱ與啟動子的結合。②特異性轉錄因子：能夠選擇性調控某種或某些基因轉錄表達的蛋白質因子稱為特異性轉錄因子。目前較清楚的是調控免疫球蛋白基因表達的核內蛋白質因子(NF)。

(2)轉錄因子的結構：反式作用因子至少含有三個功能域，即DNA結合功能域，轉錄活性功能域和其它轉錄因子結合功能域。DNA結合功能域帶共性的結構主要有：①HTH和HLH結構： 由兩段α-螺旋夾一段β-折迭構成，α-螺旋與β-折迭之間通過β-轉角或成環(huán)連接，即螺旋-轉角-螺旋結構和螺旋-環(huán)-螺旋結構。②鋅指結構：見于TFⅢA和類固醇激素受體中，由一段富含半胱氨酸的多肽鏈構成。每四個半光氨酸殘基或His殘基螯合一分子Zn2+，其余約12-13個殘基則呈指樣突出，剛好能嵌入DNA雙螺旋的大溝中而與之相結合。③亮氨酸拉鏈結構：見于真核生物DNA結合蛋白的C端，與癌基因表達調控有關。由兩段α-螺旋平行排列構成，其α-螺旋中存在每隔7個殘基規(guī)律性排列的Leu殘基，Leu側鏈交替排列而呈拉鏈狀。兩條肽鏈呈鉗狀與DNA相結合。

⑶轉錄因子的作用特點：①同一DNA順式作用元件可被不同的轉錄因子所識別;②同一轉錄因子也可識別不同的DNA順式作用元件;③TF與TF之間存在相互作用;④當TF與TF，TF與DNA結合時，可導致構象改變;⑤TF在合成過程中，有較大的可變性和可塑性。

3.轉錄激活及其調控：真核RNA聚合酶Ⅱ的激活需要依賴多種轉錄因子，并與之形成復合體。其過程首先是由TFⅡD識別啟動子序列并與之結合;繼而RNA聚合酶Ⅱ與TFⅡD、B等聚合形成一個功能性的前起始復合體——PIC;最后，結合了增強子的轉錄因子與前起始復合體結合，從而形成穩(wěn)定的轉錄起始復合體。

第十五章 基因重組和基因工程

一、自然界的基因轉移和重組：

基因重組(gene recombination)是指DNA片段在細胞內、細胞間，甚至在不同物種之間進行交換，交換后的片段仍然具有復制和表達的功能。

1.接合作用：當細胞與細胞相互接觸時，DNA分子即從一個細胞向另一個細胞轉移，這種遺傳物質的轉移方式稱為接合作用(conjugation)。

2.轉化和轉染：由外來DNA引起生物體遺傳性狀改變的過程稱為轉化(transformation)。噬菌體常?？筛腥炯毦⑵銬NA注入細菌體內，也可引起細菌遺傳性狀的改變。通過感染方式將外來DNA引入宿主細胞，并導致宿主細胞遺傳性狀改變的過程稱為轉染(transfection)。轉染是轉化的一種特殊形式。

3.整合和轉導:外來DNA侵入宿主細胞，并與宿主細胞DNA進行重組，成為宿主細胞DNA的一部分，這一過程稱為整合。整合在宿主細胞染色體DNA中的外來DNA，可以被切離出來，同時也可帶走一部分的宿主DNA，這一過程稱為轉導(transduction)。來源于宿主DNA的基因稱為轉導基因。

4.轉座：轉座又稱為轉位(transposition)，是指DNA的片段或基因從基因組的一個位置轉移到另一個位置的現象。這些能夠在基因組中自由游動的DNA片段包括插入序列和轉座子兩種類型。

⑴插入序列：典型的插入序列(insertion sequence，IS)是長750-1500bp的DNA片段，由兩個分離的反向重復序列和一個轉座酶基因。當轉座酶基因表達時，即可引起該序列的轉座。其轉座方式主要有保守性轉座和復制性轉座。

⑵轉座子：轉座子(transposons)是可從一個染色體位點轉移到另一個位點的分散的重復序列，含兩個反向重復序列、一個轉座酶基因和其他基因(如抗生素抗性基因)。

免疫球蛋白重鏈基因由一組可變區(qū)基因(VH)和一組恒定區(qū)基因(CH)構成，通過這些基因的選擇性轉座和重組，就可以轉錄表達出各種各樣的免疫球蛋白重鏈，以對付不同的抗原。

5.基因重組的方式：

⑴位點特異性重組：在整合酶的催化下，兩段DNA序列的特異的位點處發(fā)生整合并共價連接，稱為位點特異性重組。

⑵同源重組：發(fā)生在同源DNA序列之間的重組稱為同源重組(homologous recombination)。這種重組方式要求兩段DNA序列類似，并在特定的重組蛋白或酶的作用下完成。

二、重組DNA技術：

重組DNA技術又稱為基因工程(genetic engineering)或分子克隆(molecular cloning)，是指采用人工方法將不同來源的DNA進行重組，并將重組后的DNA引入宿主細胞中進行增殖或表達的過程。

1.載體和目的基因的分離(分)：對載體DNA和目的基因分別進行分離純化，得到其純品。

⑴載體：常用的載體(vector)主要包括質粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經人工構建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進行篩選的標志基因、單一的限制酶切點等。①質粒：是存在于天然細菌體內的一種獨立于細菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA，具有獨立復制的能力，通常帶有細菌的抗藥基因。②噬菌體：可通過轉染方式將其DNA送入細菌體內進行增殖。常用的為人工構建的λ噬菌體載體，當目的基因與噬菌體DNA進行重組時，可采用插入重組方式，也可采用置換重組方式。③病毒：常用的為SV40，通過感染方式將其DNA送入哺乳動物細胞中進行增殖。

⑵目的基因：①直接從染色體DNA中分離：僅適用于原核生物基因的分離。②人工合成：根據已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應于編碼小分子多肽的基因。③從mRNA合成cDNA：采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉錄酶催化合成其互補DNA(cDNA)，除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。④從基因文庫中篩選：將某一種基因DNA用適當的限制酶切斷后，與載體DNA重組，再全部轉化宿主細胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G文庫(genomic DNA library)。將某種細胞的全部mRNA通過逆轉合成cDNA，然后轉化宿主細胞，得到含全部表達基因的種群，稱為C-文庫(cDNA library)。C-文庫具有組織細胞特異性。⑤利用PCR合成：如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)技術，在體外合成目的基因。

2.載體和目的基因的切斷(切)：通常采用限制性核酸內切酶(restriction endonuclease)，簡稱限制酶，分別對載體DNA和目的基因進行切斷，以便于重組。能夠識別特定的堿基順序并在特定的位點降解核酸的核酸內切酶稱為限制酶。限制酶所識別的順序往往為4-8個堿基對，且有回文結構。由限制酶切斷后的末端可形成平端、3’-突出粘性末端和5’-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesive end)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。

3.載體和目的基因的重組(接)：即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的DNA分子。

⑴粘性末端連接法：載體與目的基因通過粘性末端進行互補粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。

⑵人工接尾法：即同聚物加尾連接法。在末端核苷酸轉移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3’-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，通過堿基互補進行粘合后，再由DNA連接酶連接。

⑶人工接頭連接法：將人工連接器(即一段含有多種限制酶切點的DNA片段)連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進行切斷，得到可以互補的粘性末端。

4.重組DNA的轉化和擴增(轉)：將重組DNA導入宿主細胞進行增殖或表達。重組質?？赏ㄟ^轉化方式導入宿主細胞，λ噬菌體作為載體的重組體，則需通過轉染方式將重組噬菌體DNA導入大腸桿菌等宿主細胞。重組DNA導入宿主細胞后，即可在適當的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)以擴增宿主細胞。

5.重組DNA的篩選和鑒定(篩)：對含有重組體的宿主細胞進行篩選并作鑒定。

⑴根據重組體的表型進行篩選：對于帶有抗藥基因的質粒重組體，可采用插入滅活法進行篩選。

⑵根據標志互補進行篩選：當宿主細胞存在某種基因及其表達產物的缺陷時，可采用此方法篩選重組體。即在載體DNA分子中插入相應的缺陷基因，如宿主細胞重新獲得缺陷基因的表達產物，則說明該細胞中帶有重組體。

⑶根據DNA限制酶譜進行分析：經過粗篩后的含重組體的細菌，還需進行限制酶譜分析進一步鑒定。

⑷用核酸雜交法進行分析鑒定：采用與目的基因部分互補的DNA片段作為探針，與含有重組體的細菌菌落進行雜交，以確定重組體中帶目的基因。

獲得帶目的基因的細菌后，可將其不斷進行增殖，從而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游帶有啟動子順序，則目的基因還可轉錄表達合成蛋白質。

第十六章 細胞信息傳遞

一、細胞間信息物質：

凡是由細胞分泌的、能夠調節(jié)特定的靶細胞生理活動的化學物質都稱為細胞間信息物質，或第一信使。

1.激素：激素(hormone)是由特殊分化細胞合成并分泌的一類生理活性物質，這些物質通過體液進行轉運，作用于特定的靶細胞，調節(jié)細胞的物質代謝或生理活動。

⑴激素的分類：激素可按照其化學本質的不同分為四類。①類固醇衍生物：如腎上腺皮質激素、性激素等;②氨基酸衍生物：如甲狀腺激素，兒茶酚胺類激素;③多肽及蛋白質：如胰島素、下丘腦激素、垂體激素等;④脂肪酸衍生物：如前列腺素。

⑵激素的作用方式：①自分泌：激素分泌釋放后仍作用于自身細胞，其傳遞介質為胞液;②旁分泌：激素分泌釋放后作用于鄰近的靶細胞，其傳遞介質為細胞間液。③內分泌：激素分泌后作用較遠的靶細胞，其傳遞介質為血液。

2.細胞因子：細胞因子是指由細胞分泌的一類信息分子，可作用于特定的靶細胞，調節(jié)細胞的生長，分化等生理功能。細胞因子也可通過自分泌、旁分泌和內分泌三種方式作用于特定的靶細胞。

常見的細胞因子有：表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等。

3.神經遞質：由神經元突觸前膜釋放的信息物質，可作用于突觸后膜上的受體，傳遞神經沖動信號。

二、細胞內信息物質：

存在于細胞內，能夠傳遞特定調控信號的化學物質稱為細胞內信息物質。

1.第二信使：在細胞內傳遞信息的小分子化學物質稱為第二信使。① 環(huán)核苷酸類：如cAMP和cGMP;② 脂類衍生物：如甘油二脂(DAG)，1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)，花生四烯酸等。③ 無機物：如Ca2+、NO等。

2.信號蛋白：細胞膜上或細胞內能夠傳遞特定信號的蛋白質分子，常與其他蛋白質或酶構成復合體以傳遞信息。如G蛋白、連接蛋白(SOS，GRB2)、鳥苷酸交換蛋白(GEF)、GTPase激活蛋白(GAP)等。

3.信號酶：細胞內能夠傳遞特定調控信號的酶蛋白分子。如胰島素受體底物-1/2(IRS1/2)、 MAPKKK(Raf-1)、MAPKK(MEK-1/2)、MAPK(ERK1/2)、PKA、PKB、PKC、PKG、PAK、PDK、CaMPK等。

三、受體的分類、結構與功能：

受體(receptor)是指存在于靶細胞膜上或細胞內的一類特殊蛋白質分子，它們能識別特異性的配體并與之結合，產生各種生理效應。

1.根據受體的亞細胞定位分類：

⑴細胞膜受體：這類受體是細胞膜上的結構成分，一般是糖蛋白、脂蛋白或糖脂蛋白。多肽及蛋白質類激素、兒茶酚胺類激素、前列腺素以及細胞因子通過這類受體進行跨膜信號傳遞。

⑵細胞內受體：這類受體位于細胞液或細胞核內，通常為單純蛋白質。此型受體主要包括類固醇激素受體，維生素D3受體(VDR)以及甲狀腺激素受體(TR)。

2.根據受體的分子結構分類：

⑴配體門控離子通道型受體：此型受體本身就是位于細胞膜上的離子通道。其共同結構特點是由均一性的或非均一性的亞基構成一寡聚體，而每個亞基則含有4~6個跨膜區(qū)。此型受體包括煙堿樣乙酰膽堿受體(N-AchR)、A型γ-氨基丁酸受體(GABAAR)、谷氨酸受體等。

⑵G蛋白偶聯型受體：此型受體通常由單一的多肽鏈或均一的亞基組成，其肽鏈可分為細胞外區(qū)、跨膜區(qū)、細胞內區(qū)三個區(qū)。在第五及第六跨膜α螺旋結構之間的細胞內環(huán)部分(第三內環(huán)區(qū))，是與G蛋白偶聯的區(qū)域。大多數常見的神經遞質受體和激素受體是屬于G蛋白偶聯型受體。

G蛋白是由α、β、γ亞基組成的三聚體，存在于細胞膜上，其α亞基具有GTPase活性。當配體與受體結合后，受體的構象發(fā)生變化，與α亞基的C-端相互作用， G蛋白被激活，此時，α亞基與β、γ亞基分離，可分別與效應蛋白(酶)發(fā)生作用。此后，α亞基的GTPase將GTP水解為GDP，α亞基重新與β、γ亞基結合而失活。

⑶單跨膜α螺旋型受體：此型受體只有一段α螺旋跨膜，受體本身具有酪氨酸蛋白激酶活性;或當受體與配體結合后，再與具有酪氨酸蛋白激酶活性的酶分子相結合，進一步催化效應酶或蛋白質的酪氨酸殘基磷酸化，也可以發(fā)生自身蛋白酪氨酸殘基的磷酸化，由此產生生理效應。

此型受體主要有表皮生長因子受體(EGFR)，胰島素受體(IR)，血小板衍生生長因子受體(PDGFR)等。此型受體的主要功能與細胞生長及有絲分裂的調控有關。

⑷轉錄調控型受體：此型受體分布于細胞漿或細胞核內，其配體通常具有親脂性。結合配體的受體被活化后，進入細胞核作用于染色體，調控基因的開放或關閉。受體的分子結構有共同特征性結構域，即分為高度可變區(qū)-DNA結合區(qū)及絞鏈區(qū)-激素結合區(qū)。①高度可變區(qū)：不同激素的受體此區(qū)的一級結構變化較大，其功能主要是與調節(jié)基因轉錄表達有關。②DNA結合區(qū)及絞鏈區(qū)：此區(qū)的功能是與受體被活化后向細胞核內轉移(核轉位)并與特異的DNA順序結合有關。③激素結合區(qū)：一般情況下，此區(qū)與一種稱為熱休克蛋白90(hsp90)的蛋白質結合在一起而使受體處于失活狀態(tài)。

四、受體與配體的結合特點：

1.高度的親和力：配體與其受體的結合具有高度親和力，多數配體與受體的解離常數為10-11～10-9mol/L。

2.高度的特異性：指一種激素或細胞因子只能選擇性與相應的受體結合的性質。

3.可逆性：配體與受體通常通過非共價鍵而結合。

4.可飽和性：由于存在于細胞膜上或細胞內的受體數目是一定的，因此配體與受體的結合也是可以飽和的。

5.結合量與效應成正比：配體的濃度越大，配體與受體的親和力越大，受體的數目越多，則配體與受體的結合量越大，產生的生理效應也越大。

五、細胞信息傳遞途徑：

1.cAMP-蛋白激酶A途徑：

通過這一途徑傳遞信號的第一信使主要有兒茶酚胺類激素、胰高血糖素、腺垂體的激素、下丘腦激素等。其受體屬于G蛋白偶聯型膜受體，G蛋白有激活型的Gs和抑制型的Gi兩種。腺苷酸環(huán)化酶(AC)存在于細胞膜上，可接受G蛋白的信號而被激活，催化ATP轉化為cAMP，導致細胞內cAMP濃度升高，從而激活蛋白激酶A(PKA)。PKA是一種四聚體，兩個亞基為催化亞基，兩個亞基為調節(jié)亞基。當調節(jié)亞基與cAMP結合后發(fā)生變構(每一調節(jié)亞基可結合兩分子cAMP)，與催化亞基解聚，從而使催化亞基激活。PKA可促使多種酶或蛋白質絲氨酸或蘇氨酸殘基的磷酸化，改變酶的催化活性或蛋白質的生理功能。

2.IP3，Ca2+-CaM激酶途徑：

通過此途徑傳遞信號的第一信使主要有：①激素：兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ等。②生長因子：PDGF、EGF等。③神經遞質：乙酰膽堿、5-羥色胺等。其受體可為G蛋白偶聯型，也可為酪氨酸蛋白激酶型。G蛋白為Gp型。通過Gp蛋白介導，存在于細胞膜上的PLCβ可被激活;而PLCγ則是在受體的酪氨酸蛋白激酶催化下，其酪氨酸殘基被磷酸化修飾而激活。PLC激活后，可催化膜上的磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸(PIP2)水解成為二脂酰甘油(DAG)及1,4,,5-三磷酸肌醇(IP3)。當IP3與存在于內質網膜上的IP3受體結合后，鈣通道開放，貯存于內質網中的Ca2+釋放進入胞液，引起胞液中Ca2+濃度升高。胞液中的鈣調蛋白(CaM)與Ca2+結合發(fā)生變構，從而激活依賴Ca2+/CaM的蛋白激酶(CaM激酶)，催化數十種酶或蛋白質的磷酸化修飾，產生相應的調節(jié)作用。

3.DAG-蛋白激酶C途徑：

此途徑的第一信使與IP3，Ca2+-CaM激酶途徑相似，也通過Gp型和另一種G蛋白介導信息，激活磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。PLD是存在于細胞膜上的另一種磷脂酶，在Ca2+的存在下，可將磷脂酰膽堿水解成為磷脂酸(PA)，PA可進一步在磷脂酸磷酸水解酶(PAP)的催化下水解生成DAG，是DAG的另一生成途徑。胞液中DAG濃度升高，可致蛋白激酶C激活。該酶可催化底物蛋白質絲氨酸或蘇氨酸殘基的磷酸化。經典的蛋白激酶C需在Ca2+，DAG和磷脂酰絲氨酸的存在下才能被激活。

4.Ras-MAPK途徑：

已知胰島素和大部分的生長因子經此途徑傳遞信號。主要過程為：EGF + EGFR → SHC磷酸化 → 形成SHC-SOS-GRB2-Ras復合體 → Ras激活 → Raf-1激酶↑ → MEK1/2 ↑ → ERK1/2 ↑ → 細胞生長與調亡。

5.胞內受體介導途徑：

通過細胞內受體傳遞信號的第一信使有：①類固醇激素;②1,25-(OH)2D3;③甲狀腺激素。當激素與受體結合后，引起hsp90與受體解離，受體被活化;活化受體核轉移并與HRE結合;特異基因去阻遏且RNA聚合酶活性增高，特異基因表達及特異蛋白質合成，產生特定的生理效應。

第二十一章 癌基因和抑癌基因

一、癌基因的概念及分類：

癌基因(oncogene)是指存在于正常細胞內，與細胞生長發(fā)育調控有關的一組結構基因。癌基因可按其來源不同而分為病毒癌基因(v-onc)和細胞癌基因(c-onc)。

1.病毒癌基因：

具有致癌性的腫瘤病毒有兩種類型：一種是DNA腫瘤病毒，另一種是RNA病毒即逆轉錄病毒。DNA腫瘤病毒的基因組的早期功能基因編碼轉化蛋白，如病毒SV40的 A基因編碼大T抗原，分布于胞核，可與p53結合而使之失活。RNA病毒基因組中可含有致癌基因，并表達相應的轉化蛋白，感染動物后即可誘發(fā)腫瘤。

2.細胞癌基因：

細胞癌基因(c-onc)又稱為原癌基因(protooncogene)，大多數的原癌基因屬于調控細胞生長分化的正常基因，原癌基因的蛋白產物是通過影響細胞生長分化中的控制系統(tǒng)而起作用的。原癌基因激活后可引起細胞生長分化失控，從而導致細胞癌變。目前發(fā)現的細胞癌基因已超過100種，根據這些基因表達蛋白產物的功能可將細胞癌基因分為四大類：

⑴生長因子類：如c-sis癌基因，其編碼產物為PDGF的β鏈。

⑵G蛋白類：如ras家族，其編碼產物為存在于細胞膜上的G蛋白，能傳遞生長信號。

⑶受體及信號蛋白類：如src家族，其編碼產物為細胞內的生長信號傳遞蛋白，通常含酪氨酸蛋白激酶活性。

⑷轉錄因子類：如myc家族和myb家族，其編碼產物為存在于細胞核內的轉錄因子。

二、癌基因的激活機制：

1.插入激活：指來源于病毒等的啟動子或增強子插入到細胞癌基因的附近或內部而使其開放轉錄。

2.基因重排：基因從正常位置轉移到另一位置，常常是插入一啟動子后而使其轉錄活性增加。

3.基因擴增：基因數量的增加。

4.突變點：ras癌基因的點突變，導致其GTPase活性下降，從而使其保持激活狀態(tài)。

三、抑癌基因及其作用機制：

抑癌基因又稱為抗癌基因(anti-oncogene)，是指存在于正常細胞中，其編碼產物能抑制細胞生長增殖的一組結構基因。常見的抑癌基因有Rb基因，p53基因，p16基因等。其中，Rb基因編碼p105Rb轉錄因子，p53基因編碼p53轉錄因子，p16基因編碼一種p16蛋白。

1.Rb基因的作用機制：

Rb基因的失活主要與視網膜母細胞瘤的發(fā)生相關。低磷酸化型的p105Rb可與促進細胞分裂的轉錄因子E2F結合形成復合物，從而阻止E2F對某些與細胞增殖相關的基因啟動轉錄。高磷酸化型的p105Rb則可促使其與E2F轉錄因子分離，從而使其呈現活性，細胞即由G1期進入S期。

2.p53基因的作用機制：

p53蛋白一般都位于核內，可與特異的DNA片段結合。其酸性區(qū)域具有許多轉錄調節(jié)因子的共同特征，并與寡聚體的形成有關。p53蛋白能以四聚體的形式與DNA結合，調節(jié)其它基因的表達。p53蛋白的生物學功能有：① 轉錄調節(jié)及抑制細胞生長的作用：p53蛋白促進WAF1/CIP1基因表達產生一種分子量為21kD的蛋白質(p21WAF1/CIP1)，誘導細胞生長停滯于G1期。② 參與程序性細胞凋亡：p53 蛋白啟動不能修復的損傷細胞進入程序性凋亡。③ 抑制DNA復制：p53蛋白與復制蛋白A(repA)結合后可抑制其與單鏈DNA的結合，阻止細胞進入S期。

第二十三章 分子生物學常用技術

一、分子雜交與印漬技術的原理：

1.分子雜交：

不同來源的單鏈核酸(DNA或RNA)，只要它們具有大致相同的堿基序列，經過退火處理，就能重新形成雜種雙螺旋，這一現象稱為分子雜交(molecular hybridization)。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。

2.印漬技術：

印漬技術的原理首先由Edwen Southern在1975年提出。其基本操作過程是：將DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳分離后，置NaOH液中浸泡，從而將凝膠中的DNA變性為單鏈;然后將一張硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，上面放上大量吸水紙巾，利用吸水紙巾的毛細作用，將單鏈DNA從凝膠中轉移到硝酸纖維素膜上，再將膜置80℃烘干并使單鏈DNA分子固定在膜上，再用于分子雜交分析。因此，用于DNA印漬的技術又稱為Southern Blotting或Southern 雜交。

3.探針技術：

將已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料進行標記，然后用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術，使雜交區(qū)帶顯現出來。

二、印漬技術的類別及應用：

1.DNA印漬技術：又稱為Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析。

2.RNA印漬技術：又稱為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。

3.蛋白質印漬技術：又稱為Western雜交，或免疫印漬技術，即利用抗原-抗體反應，檢測轉移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質。

三、PCR技術：

1.PCR的概念：PCR(polymerase chain reaction)即聚合酶鏈反應技術，是指利用耐熱DNA聚合酶的反復作用，通過變性-延伸-復性的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴增數百萬倍的一種操作技術。

2.PCR反應系統(tǒng)的組成：

⑴耐熱DNA聚合酶(Taq酶)：這是由耐熱水生細菌體內提取的一種DNA聚合酶。

⑵模板DNA：即待分析的目的DNA，其長度不宜大于10kb。

⑶兩種引物：為了保證DNA聚合酶能夠對兩條互補鏈均能進行延伸，需要兩種引物，分別位于兩條互補模板DNA鏈的3`-端。

⑷四種脫氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPS。

⑸緩沖溶液：保證DNA聚合酶催化時所需的適當的溶液pH值。

3.PCR的反應原理：一般采用變性-復性-延伸三步循環(huán)，也可采用變性-延伸兩步循環(huán)。

⑴變性：將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到950C，使雙螺旋DNA解開成為單鏈。

⑵復性：通過降低反應溫度至550C，使兩種引物能與兩條解開的DNA互補鏈的3`端粘合。

⑶延伸：將反應溫度提高到約700C，在耐熱DNA聚合酶的催化下，合成兩條互補鏈，從而使模板DNA擴增一倍。按照上述步驟重復操作約30次，即可將模板DNA擴增數百萬倍。

4.PCR的主要用途：

⑴目的基因的克?。菏茄杆佾@得一定量的目的基因的有效方法之一。① 利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板，獲得已知的目的基因;② 利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有同源性的DNA片段;③ 利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機獲得目的基因。

⑵基因的體外突變：采用隨意設計的引物，在體外對基因進行嵌合、缺失、點突變等改造。

⑶DNA的微量分析：由于PCR技術具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析檢測。

四、DNA堿基序列測定：

DNA堿基序列測定即DNA一級結構的測定，目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的化學裂解法和Sanger建立的雙脫氧末端終止法。雙脫氧末端終止法的主要操作步驟有：

1.獲得待測DNA片段的單鏈模板：一般采用基因工程的方法以獲取一定數量的單鏈待測DNA模板?？蓪⒋郎yDNA片段與噬菌體M13DNA進行重組，然后將其導入大腸桿菌進行增殖，M13噬菌體一般以單鏈DNA形式透出細胞再感染新的細菌，故此可獲得單鏈DNA模板。

2.合成寡核苷酸引物：利用DNA合成儀合成一段與待測DNA片段的3’-端互補的寡核苷酸引物。

3.模板-引物雜交：將待測單鏈DNA模板與寡核苷酸引物混合，并進行保溫處理，使引物與DNA單鏈模板的3’-端進行雜交。

4.互補鏈的延長和終止：將上述雜交混合液分為四份，每份混合液中均加入DNA聚合酶，四種dNTPS，一種帶放射性同位素標記的脫氧核糖核酸(如α-32P-dATP)。此外還需分別加入一種雙脫氧核糖核酸(ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP)。然后在適當溫度條件下延伸互補鏈，就可得到四組分別以A、G、C、T、終止的長短不一的互補鏈的混合物。

5.電泳分離：將四組含有長短不等的反應混合物在同一聚丙烯酰胺凝膠板上進行電泳，即可將只相差一個核苷酸的寡核苷酸鏈分離開。

6.放射自顯影：將電泳凝膠進行放射自顯影，即可得到放射自顯圖譜，通過該圖譜即可直接讀出核苷酸的排列順序。

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（責任編輯：何以笙簫默）

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