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酶的純化
酶是蛋白質,因此凡用于蛋白質的純化手段均適用于酶的純化,如鹽析法、聚乙二醇沉淀法、有機浴劑分級沉淀法、等電點法、選擇性沉淀法、各種柱層析法(吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾)、各種電泳法及親和層析等。不同之處是酶的純化過程尚需選用迅速簡便的活力測定方法,以追蹤酶的去向。在選用酶的活力測定方法時,分析方法的迅速要比其精確度更為重要。如寧可要一個需時5min,準確度為5%的方法;也不要一個需時30min,準確度為0.5%的方法。在建立活力測定法之后,再根據(jù)各單元純化步驟及活力分布情況用列表形式表達,表的內容包括:操作步驟、總體積、酶濃度(每毫升酶活力)、總活力、蛋白質濃度mg/ml)、比活力(即純度、酶活力單位/毫克蛋白)、產(chǎn)率%(每步總活力除以第一步的總活力)和純化倍數(shù)(每步比活力除以第一步比活力)。
一個典型的酶純化過程常包括多個單元操作,各單元操作如何串聯(lián),需靠實踐摸索。每經(jīng)過一個步驟一般可提高酶純度2一3倍,總純度可提高數(shù)千倍,而總產(chǎn)率常僅百分之幾或十幾。總的原則是選用最少的步驟而能取得最好的純化效果、因為增加步驟勢必增加酶的丟失。通常對于含鹽濃度高的粗提取液一般不宜采用吸附法而多用鹽析法;對于低離子強度的酶溶液則可用吸附法或離子交換法。交替使用不同分級沉淀法常比單獨重復同一類型方法更能奏效。所以常將吸附法、鹽折法和有機溶劑分級沉淀法串聯(lián)起來進行純化。當這些方法仍達不到要求時,還可以采用一些包括電泳、層析法在內的其他類型純化方法。
當酶達到一定純度時,便可以進行結晶,結晶也是純化酶的有效手段之一。但應注意的是藥用酶有些并不需要結晶。酶的第一次結晶純度有時仍低于50%。酶的結晶通??梢栽谳^純的酶液中添加硫酸銨、氯化鈉等鹽達到一定飽和度,使酶慢慢結晶出來。此時必須控制溫度和pH值。鹽濃度要逐漸提高,添加速度要慢,才能得到較好的結晶。有時在低溫下,用丙酮、乙醇等有機溶劑進行結晶。近年來采用平衡透析法,即將酶液裝人透析袋中,置于一定飽和度的鹽溶液中進行透折,這種操作可以獲得大量結晶。
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2014年執(zhí)業(yè)藥師資格考試時間 10月18-19日
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(責任編輯:中大編輯)
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